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May 27, 2024

Biologie des communications volume 6, Numéro d'article : 474 (2023) Citer cet article

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La technologie de broyage à faisceau ionique cryo-focalisé (cryo-FIB) a été développée pour la fabrication de cryo-lamelles de spécimens natifs congelés pour étude par tomographie cryo-électronique in situ (cryo-ET). Cependant, la précision de la cible d’intérêt reste l’un des principaux goulots d’étranglement limitant l’application. Ici, nous avons développé un système de microscopie optique et électronique cryo-corrélative (cryo-CLEM) nommé HOPE-SIM en incorporant un système de microscopie à fluorescence (SIM) à illumination structurée 3D et un étage à vide poussé amélioré pour obtenir une cryo-FIB efficacement ciblée. Avec la super résolution 3D de cryo-SIM ainsi que notre logiciel cryo-CLEM, 3D-View, la précision de corrélation de la région d'intérêt de ciblage peut atteindre 110 nm, suffisamment pour la fabrication ultérieure de cryo-lamelles. Nous avons utilisé avec succès le système HOPE-SIM pour préparer des cryo-lamelles ciblant les mitochondries, les centrosomes des cellules HeLa et le compartiment d'assemblage du virus de l'herpès des cellules BHK-21 infectées, ce qui suggère la grande puissance du système HOPE-SIM pour le futur cryo-ET in situ. flux de travail.

Révéler des ultrastructures cellulaires tridimensionnelles (3D) est une étape importante dans la compréhension de la vie. Ces dernières années, la cryomicroscopie électronique (cryo-EM) s'est de plus en plus améliorée et est devenue l'une des principales techniques biophysiques utilisées pour étudier les structures 3D à haute résolution de complexes macromoléculaires1. En outre, la tomographie cryoélectronique (cryo-ET) est devenue un autre outil puissant pour visualiser l'organisation macromoléculaire de paysages cellulaires non perturbés, avec le potentiel d'atteindre une résolution proche de l'atome. Pour visualiser l'ultrastructure subcellulaire dans les cellules vitrifiées par cryo-ET, un broyage par faisceau d'ions focalisé dans des conditions cryogéniques (cryo-FIB) a été utilisé pour préparer de fines cryo-lamelles à partir de cellules vitrifiées, permettant ainsi de nombreuses observations biologiques passionnantes à l'intérieur des cellules. L'organisation tridimensionnelle des organites cellulaires, tels que le cytosquelette5,6,7,8,9, le réticulum endoplasmique (RE)10 et le protéasome 26S11, a été analysée avec succès par cryo-ET.

Il existe plusieurs limitations qui empêchent une application plus large de la cryo-ET, notamment des difficultés à localiser et à identifier les caractéristiques intéressantes12. La microscopie optique et électronique cryocorrélative (cryo-CLEM)13,14,15,16,17,18 s'est avérée être une approche efficace pour surmonter ce problème en utilisant le marquage fluorescent pour naviguer vers la cible du cryo-FIB ultérieur. broyage de cellules vitrifiées14,15,16,17 ou imagerie cryo-ET de coupes congelées-hydratées12,18. Étant donné que l’épaisseur normale des cellules est bien au-delà du libre parcours moyen des électrons de 300 keV, la fabrication de cellules vitrifiées jusqu’à une épaisseur d’environ 200 nm est nécessaire avant la collecte de données cryo-ET. Par conséquent, la procédure expérimentale séquentielle de vitrification, de microscopie à cryofluorescence (cryo-FM), de cryo-FIB et de cryo-ET est devenue un flux de travail de routine pour de nombreuses études structurelles in situ spécifiques à un site12,19,20,21,22, 23. Ce flux de travail nécessite normalement un microscope à fluorescence autonome doté d'un cryo-étage pour l'imagerie par cryo-fluorescence15,16,17,24,25, suivi d'une microscopie électronique à cryo-balayage (cryo-SEM). Un alignement de corrélation entre les images cryo-FM et cryo-SEM est généré et utilisé pour guider le fraisage cryo-FIB12,18,21,26. De plus, des marqueurs de repère spécifiques imagés par cryo-FM et cryo-FIB, tels que des billes fluorescentes, sont nécessaires pour l'alignement de corrélation à l'aide d'un logiciel corrélatif 3D spécifique21,27. De nombreuses implémentations matérielles ont été signalées pour réaliser ce flux de travail en développant la microscopie cryogénique à fluorescence à grand champ13,21,22 ou la microscopie confocale cryo-Airyscan à haute résolution (CACM)12.

La précision de la corrélation et le taux de réussite entre la cryo-FM et la cryo-FIB sont limités par la résolution de la cryo-FM et encore atténués par les facteurs de déformation des échantillons, de dévitrification et de contamination par la glace7,21. Nous avons précédemment développé une plate-forme optique unique sous vide poussé pour le cryo-CLEM (HOPE)25, qui utilisait un cryo-support intégratif et une chambre à vide spécifique pour minimiser la contamination par la glace et réduire le risque de déformation et de dévitrification des échantillons pendant l'imagerie cryo-FM et transfert d'échantillon. Cependant, l'utilisation d'un microscope à fluorescence à grand champ avec un objectif à faible ouverture numérique (NA) et sans l'information sur la position z des cibles fluorescentes dans notre système HOPE a limité la précision de la corrélation au-dessus d'un micron, qui doit être améliorée. pour augmenter le taux de réussite du broyage cryo-FIB spécifique au site.